在ELISA试剂盒当中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其间包含：
1. 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其方法可所以凹孔平板、试管、珠粒等。现在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在运用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，调查其显色反应是否均一性，据此判明其吸附功能是否良好。
2. 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体外表时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有必定影响,一般多选用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它实验条件相一同，调查阳性标本的OD值。选择OD值zui大而蛋白量最少的浓度。关于多数蛋白质来说一般为1～10μg／ml。
3. 酶符号抗体作业浓度的选择：首先用直接ELISA法进行开始效价的滴定(见酶符号抗体部份)。然后再固定其它条件或采纳“方阵法”(包被物、待检样品的参阅品及酶符号抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其作业浓度。
4. 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体有潜在的致癌作用，应留意防护。有条件者应运用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是现在较为满意的供氢体。ELISA试剂盒底物作用一段时间后，应参与强酸或强碱以停止反应。一般底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物运用液有必要新鲜配制，尤其是H2O2在临用前参与。
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